Teknik Sequencing DNA (Biomolekuler)

Rangkuman Singkat Teknik Sequensing DNA

0
1724

Sequencing DNA dan kloning DNA adalah alat yang digunakan dalam penelitian genetik dan bioteknologi. Mengetahui struktur molekul DNA dengan dua Strand komplemen dan sewuencing digunakan dalam penelitian biologi molekuler. Kuncidari teknik ini adalah hibridisasi asam nukleat, mempasangkan satu strand asam nukleat terhadap sequen komplemen pada strand dari molekul asam nukleat lain.

Pada kesempatan ini, kita akan membahas teknik sequensing DNA. Kemudian kita akan membahas metode penting dalam teknologi genetika, dan manipulasi langsung gen untuk tujuan praktik klinis.

Sequencing DNA

Sequencing DNA adalah peneliti dapat memanfaatkan prinsip pasangan komplemen dasar untuk menentukan sequensing nukleotida kompleks dari molekul DNA. DNA adalah irisan pertama menjadi fragmen, dan kemudian setiap fragmen disequensing. Sekarang sequensing dilakukan dengan mesin.

Prosedur otomatis digunakan teknik yang disebut dengan Dideoksiribonukleotida Chain termination sequencing. Pada teknik ini, satu helai (strand) fragmen DNA diguakan sebagai template untuk mensintesis satu set fragmen komplemen, dimana digunakan untuk menganalisa sequensingnya. Teknik ini pertama kali dikenalkan oleh frederick sanger dan dia memperoleh nobel pada tahun 1980. Teknik sequensing dideoxy sampai sekarang masih digunakan untuk proyek sequensing skala kecil.

Pada 10 tahun terakhir, generasi terbaru sequensing telah dikembangkan. Spesifik helai masing masing fragmen diimobilisasi dan strand komplemen di sintesis, satu nukleotida pada satu waktu. Teknik kmiawi dengan monitor elektronik untuk mengidentifikasi realtime dari 4 nukleotida yang ditambahkan. Metode ini disebut dengan Sequensing dengan Sintesis.

Ribuan hingga jutan frabmen masing-masing terdiri dari 400-1000 nukleotida panjang, dan disequensing pararel di mesin dengan kecepatan tinggi sequensing nukleotida setiap jamnya. Teknik lainnya dikembangkan disebut dengan sequensing generasi ketiga dimana lebih cepat dan lebih murah biayanya dibandingkan seri sebelumnya.

Baca Juga:  Protokol Isolasi RNA dengan Kit Geneaid

Pada metode terbaru, DNA dipotong menjadi fragment-fragmen. Beberapa kelompok telah bekerja dengan memindahkan strand tunggal molekul DNA melalui celah kecil pada membran (nanopore). Celah porus ini adalah channel protein pada membran lipid.

Setelah sequensing genom manusia diumumkan, peneliti telah melengkapi sequensing 4000 bakteri, 190 archae, dan 180 genom eukariotik dengan lebih dari 17000 spesies. Genom komplit telah ditentukan untuk beberapa sel kanker pada manusia dan berbagai bakteri pada usus manusia.

Metode Sequencing DNA : Terminasi Rantai Dideoxy

Tujuan dan Kegunaan : Sequensing nukleotida pada DNA fragmen sekitar 800-1000 pasang dapat ditentukan dengan cepat dengan mesin berupa reaksi sequensing, dan memisahkan produk reaksi yang terlabelisasi .

Tekniknya : metode ini didasarkan dari sintesa neste strand komplemen DNA ke satu strand fragmen DNA. Pada strand baru dimulai dengan primer sama dan diakhiri dengan dideoksyribonukleotida (ddNTP), yang merupakan modifikasi dari deoksyribonucleotida (dNTP). Inkorporasi dari ddNTP menterminasi pertumbuhan strand DNA karena kekurangan 3’-OH, sisi perlekatan nukleotida selanjutnya. Pada strand baru, masing-masing posisi nukleotida diantara sequensing original, merepresentasikan strand akhir dengan komplemen ddNTP. Karena masing-masing jenis ddNTP dibedakan dengan label flouresen, identifikasi nukleotida akhir strand baru, dan sequencing original dapat ditentukan.

  1. Fragmen DNA yang disequance didenaturasi menjadi strand tunggal dan diinkubasi pada tabung pemeriksaan dengan bahan yang diperlukan untuk Sintesis DNA : primer di design duntuk berpasangan dengan strand template, polimerase DNA, 4 dNTPs dan 4 ddNTPs, masing-masing di tag dengan molekul flouresen spesifik.
  2. sintesis masing-masing strand baru pada3; dari primer, hingga ddNTP disisipkan pda equivalent dNTP. ddNTP yang inkorporate mencegah elongasi dari strand. Satu set strand ter label tergererasi dengan warna tag yang merepresentasikan nukleotida terakhir di sequensing.
  3. strand yang terlabelasi dalam campuran, dipisahkan dengan gel yang membuat strand pendek pindah lebih cepat dibandingkan stand yang panjagng. Untuk DNA sequensing, gel terdapat pada tubulus kapiler dan berdiameter kecil, membuat detektor flouresense mendeteksi warna flouresensi strand. Panjang strand pada satu nukleotida dapat dibedakan dari masing-masing dengan lainnya.
Baca Juga:  Protokol Ekstraksi miRNA dari sampel Jaringan

Hasilnya : warna flouresense masing-masing strand mengindikasikan identifikasi nukleotida pada 3’. Hasil di print sebagai spektogram, dan sequense yang komplemen dengan strand template dapat dibaca dari bawah (strand pendek) ke atas (strand panjang). Ingatlah bahwa sequens disini mulai setelah primer.

Metode Sequencing DNA Generasi Berikutnya

Tujuan dan Kegunaan : pada sequensing generasi berikunya, masing-masing fragmen memiliki panjang 400-1000 nukleotida, tersusun pararel, dan sekitar 700-900 juta nukleotida dapat disequensing dalam 10 jam.

Tekniknya :

  1. DNA genom terfragmentasi dan fragmen 400-1000 pasang dipilih.
  2. masing-masing fragmen diisolasi dengan bead pada droplet larutan cair
  3. fragemen dicopi dengan teknik PCR. Semua 5’ dari 1 strand di tangkap oleh bead. Sekitar 1 juta kopi identik pada strand tunggal, yang digunakan pada template strand ditempelkan ke bead.
  4. bead ditempatkan pada well kecil dengan DNA polimerasi dan primer yang dapat dihibridisasi ke 3’ template strand tunggal.
  5. well adalah 1 dari 2 juta pada plate multiwell masing-masing terdiri dari fragmen DNA yang berbeda untuk disequensing. Larutan 1 dari 4 nukleotida ditambahkan pada semua well dan kemudian dicuci. Urutan sequensing adalah 4 nukleotida yaitu dATP, dTTP, dGTP dan dCTP. Proses ini kemudian diulangi.
  6. masing-masing well, jika template komplemen, ditambahkan nukleotida misal T ditambah A, nukleotida bergabung pada strand yang tumbuh, melepaskan Ppi, yang menyebabkan kilatan cahaya yang dapat direkam.
  7. nukleotida di cuci dan nukleotida lainnya (misal dTTP) ditambahkan. Jika nukleotida tidak komplemen pada template base (misalnya G), ini tidak akan bergabung dengan strand dan tidak ada kilatan cahaya.
  8. proses penambahan dan mencuci 4 nukleotida diulangi sampai setiap fragmen lengkap strand komplemennya. Bentuk dari kilatan menunjukkan sequensing pada fragmen original pada masing-masing well.
Baca Juga:  Fase Uji Klinik (Clinical Trial) Penelitian : Fase 0 hingga IV

Hasilnya : masing-masing 2.000.000 well pada plate multiwell, dengan fragmen yang berbeda dan sequensing berbeda. Hasilnya untuk 1 framen terlihat pada flow-gram. Sequensing pada fragmen dianalisis menggunakan shofware komputer bersamaan.

Intepretasi : Jika template strand memiliki 2 atau lebih nukloeitida pada baris, nukleotida komplemen akan ditambahkan satu setelah yang lain pada step yang sama. Tulislah sequensing pertama 25 nukleotida pada flowgram dari kiri dan abaikan garis yang sangat pendek.

Oleh: dr. M. Wiwid Santiko
Yogyakarta, 12 Juli 2017

Ringkasan Artikel
Teknik Sequencing DNA
Judul Artikel
Teknik Sequencing DNA
Deskripsi
Sequencing DNA dan kloning DNA adalah alat yang digunakan dalam penelitian genetik dan bioteknologi meliputi Terminasi Rantai dideoxy dan Sequensing Generasi Berikutnya.
Author
Publisher Name
DokterMuslim
Publisher Logo

LEAVE A REPLY

Please enter your comment!
Please enter your name here