Protokol Ekstraksi miRNA dari sampel Jaringan

Protokol ekstraksi miRNA dilakukan untuk memperoleh dan memisahkan micro RNA dengan komponen lain yang ada di dalam jaringan sampel. Sampel dapat berasal dari jaringan apapun, termasuk jaringan otot, kulit, organ, dan jaringan lainnya.

Secara umum, jaringan yang di ambil dari biopsi atau tindakan pembedahan, apabila anda ingin memeriksa RNA, maka dapat melakukan prosedur ini. Protokol Ekstraksi miRNA ini berbeda dengan Isolasi RNA biasa. Dan juga berbeda dengan isolasi DNA.

Alat dan Bahan Protokol Ekstraksi miRNA

Alat dan bahan tersebut diantaranya : sentrifus, micropipet, mortar dan pasile, termos, vorteks, cold black 1,5 ml, tube 1,5 ml, tip filter dari DF10, DF30, DF 200 dan DF1000, plastik, Nitrogen cair dan waterbath 55 derajat celcius.

Sedangkan kit yang disiapkan adalah kit eksikon mircury dengan RNA isolation kit jaringan. Lalu siapkan Betamerkaptoetanol, aquades, dan sampel tentunya. Untuk penggerusan, siapkan cawan dan mortar (seperti cobek dan ulegan).

Hati-hati dalam menggunakan nitrogen cair. Nitrogen cair ditaruh di termos, dan pastikan anda memakai gloves. Karena meskipun dingin, apabila nitrogen cair mengenai kulit, akan memicu luka bakar yang membuat kulit melepuh.

Preparasi Protokol Ekstraksi miRNA

1. Tambahkan 90 ml ethanol 96-100% ke dalam splash solution dan campur.
2. Buat campuran lysis solution 1 ml dan 10 micro liter Beta-mercaptoethanol, dan campurlah serta dibuat fres.
3. Jaringan dikeluarkan dari penyimpanan -80 derajat celcius.
4. Timbang jaringan antara 20-40 mg
5. Siapkan nitrogen cair (N2) dan taruh di termos.

Protokol Ekstraksi miRNA

1. Ambilah jaringan yang sudah dipotong, lalu masukkan dalam mortar
2. Tambahkan nitrogen cair, sambil digerus dengan pastle sampai jaringan seperti serbuk. Catatan, jika nitrogen habis karena menguap, maka dapat ditambah lagi hingga jaringan seperti serbuk.
3. Tambahkan 300 microliter lysis solution yang sudah ditambah dengan beta-mercaptoethanol, campurlah hingga homogen.
4. Pindahkan ke tabung 1,5 ml (boleh save lock maupun non save lock).
5. Tambahkan 600 microliter RNAse free water, kemudian vorteks
6. Tambahkan 20 microliter proteinase K, kemudian vorteks lagi.
7. Lakukan pada semua jaringan baik sampel maupun kontrol.
8. Kemudian inkubasi dengan suhu 55 derajat celcius, selama 15 menit, sambil di vorteks.
9. Setelah itu, sentrifugasi dengan kecepatan 14.000 g, selama 1 menit.
10. Pindahkan supernatan ke RNAse-free microcentrifuge tube
11. Tambahkan 450 microliter ethanol 96-100%, kemudian vorteks.
12. Pindahkan 650 microliter lysate ke dalam column, lalu sentrifugasi dengan kecepatan 3500 g selama 1 menit. Catatan, jika supernatan tidak turun, ulangi sentrifugasi 14.000 g selama 1 menit.
13. Ulangi step 12.
14. Masukkan 400 microliter wash solution ke dalam column
15. Sentrifugasi 14.000 g selama 2 menit, tampa penambahan apa-apa, tujuannya untuk mengeringkan column.
16. Pindahkan column ke tabung microcentrifus 1,5 ml.
17. Masukkan 50 ml Elution Buffer ke dalam column
18. Sentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 200 g.
19. Sentrifugasi lagi dengan kecepatan 14.000 g selama 1 menit.
20. Simpan RNA dalam microsentrifuge -20 derajat celcius, kemudian simpan ke dalam kulkas – 80 derajat celcius, dan siap di lakukan qPCR dengan two step.
21. Bereskan dan bersihkan tempat kerja.

Oleh. dr. Wiwid Santiko